Desvendando o processo de clivagem do DNA da enzima Sau3AI

Sau3AI é uma enzima de restrição tipo II amplamente utilizada para manipulação genética, como construção de bibliotecas de genoma. Sau3AI consiste em dois domínios, o domínio N-terminal (Sau3AI-N) e o domínio C-terminal (Sau3AI-C). Ainda não está claro como esses dois domínios funcionam juntos para cortar o DNA.

Recentemente, uma equipe de pesquisa liderada pelo Prof. YU Feng do Instituto de Pesquisa Avançada de Xangai (SARI) da Academia Chinesa de Ciências e pelo Prof. HE Jianhua da Universidade de Wuhan relatou um mecanismo de autoativação no qual o domínio C-terminal Sau3AI abre o Domínio catalítico N-terminal através de efeitos alostéricos para alcançar clivagem de sítios específicos de DNA.

Os resultados foram publicados na Structure em 30 de agosto.

Devido à atividade de clivagem do DNA, Sau3AI não pode ser expresso em Escherichia coli e, assim, um mutante de sítio catalítico, Sau3AI-E64A, foi utilizado para expressão exógena e pesquisa estrutural. A estrutura cristalina do mutante Sau3AI-E64A revela que quando o DNA não está ligado, uma região de loop (333-342) do domínio C-terminal paira sobre o sítio de ligação do DNA do domínio N-terminal, impedindo que o domínio N-terminal se ligue a ADN.

A análise do domínio C-terminal de Sau3AI e da estrutura do complexo de DNA indicou que a região da alça (261-268 e 280-295) do domínio C-terminal foi significativamente alterada após a ligação ao DNA, implicando que Sau3AI pode sofrer alterações conformacionais após C-terminal domínio se liga ao DNA.

Além disso, os pesquisadores conduziram experimentos de mudança de gel nos mutantes de resíduos de aminoácidos chave de ligação ao DNA (K257A, S424A e T435A) no domínio C-terminal para confirmar que o DNA de ligação C-terminal desempenha um papel crucial na ativação da atividade catalítica de N- domínio terminal. Estes resultados sugerem que o domínio C-terminal ativa a atividade enzimática do domínio N-terminal através de efeitos alostéricos.

Os pesquisadores sugeriram que Sau3AI é uma enzima de restrição do tipo IIE, mas ao contrário de outras enzimas de restrição do tipo IIE, é monomérica e não homodímera. Dois domínios diferentes em Sau3AI desempenham um papel semelhante aos homodímeros em outras enzimas de restrição do tipo IIE, sugerindo que Sau3AI representa uma nova subclasse de enzimas de restrição do tipo IIE.